الاختلاف الرئيسي بين مقايسات PCR التقليدية المتداخلة والوقت الحقيقي هو أن PCR التقليدي هو تقنية تم تطويرها لتضخيم تسلسلات معينة من DNA و PCR المتداخل هو تعديل لـ PCR التقليدي الذي يتكون من تفاعلين تضخيم متسلسل ، بينما حقيقي - الوقت PCR هو متغير من PCR التقليدي القادر على تحديد المنتج المضخم.
PCR هي تقنية علمية شائعة جدًا تستخدم على نطاق واسع في البحث والطب لاكتشاف الحمض النووي. تُستخدم اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للكشف عن المستضدات عن طريق الكشف عن الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي. بشكل عام ، يوجد الحمض النووي الريبي الفيروسي في الجسم قبل اكتشاف الأجسام المضادة أو عرض أعراض المرض.يمكن أن يحدد اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل ما إذا كان شخص ما مصابًا بالفيروس أم لا. حاليًا ، PCR هو الاختبار القياسي للكشف عن مرض COVID-19. هناك أنواع مختلفة من تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي ، تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل ، تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال ، بدء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، و PCR بعيد المدى ، إلخ.
ما هي فحوصات PCR التقليدية؟
مقايسة PCR التقليدية هي تقنية تضخيم الحمض النووي في المختبر يتم إجراؤها بشكل روتيني في المختبرات البيولوجية الجزيئية. مكنت هذه الطريقة من إنتاج آلاف إلى ملايين النسخ من جزء معين من الحمض النووي. قدم كاري موليس هذه التقنية في عام 1980. تتطلب هذه التقنية قطعة DNA تُعرف بالقالب لعمل نسخ عديدة منها. يعمل Taq polymerase على أنه إنزيم DNA polymerase ويحفز تخليق خيوط جديدة من تسلسل القالب.
ستعمل البادئات في خليط PCR كنقاط بداية لتمديدات الشظايا. يتم تضمين جميع المكونات الضرورية لعمل نسخ من الحمض النووي في خليط PCR.يتم تشغيل تفاعل PCR في جهاز PCR ، ويجب تغذيته بخليط PCR الصحيح وبرنامج PCR الصحيح. إذا كان خليط التفاعل والبرنامج صحيحين ، فسوف ينتج العدد المطلوب من نسخ قسم معين من الحمض النووي من كمية صغيرة جدًا من الحمض النووي.
الشكل 01: مقايسة PCR التقليدية
هناك ثلاث خطوات رئيسية متضمنة في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل: التمسخ ، التلدين التمهيدي ، وتمديد الخيط. تحدث هذه الخطوات الثلاث عند ثلاث درجات حرارة مختلفة. يحافظ محلول PCR المؤقت على الظروف المثلى لعمل بوليميراز Taq. يتم تكرار هذه المراحل الثلاث من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لإنتاج الكمية المطلوبة من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل. في كل تفاعل PCR ، يتضاعف عدد نسخ الحمض النووي.وبالتالي ، يمكن ملاحظة التضخيم الأسي في تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن حل منتج PCR باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام لأنه ينتج كمية مرئية من الحمض النووي على مادة هلامية ، ويمكن تنقيته لإجراء مزيد من الدراسات مثل التسلسل.
PCR هي أداة قيمة في البحوث الطبية والبيولوجية. لا سيما في دراسات الطب الشرعي ، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) له قيمة هائلة لأنه يمكنه تضخيم الحمض النووي للدراسات من العينات الصغيرة للمجرمين وإنشاء ملفات تعريف الحمض النووي الخاصة بالطب الشرعي. يستخدم PCR على نطاق واسع في العديد من مجالات البيولوجيا الجزيئية بما في ذلك ، التنميط الجيني ، واستنساخ الجينات ، وكشف الطفرات ، وتسلسل الحمض النووي ، والمصفوفات الدقيقة للحمض النووي ، واختبار الأبوة.
ما هي فحوصات PCR المتداخلة؟
المتداخل PCR هو نوع من PCR يقلل من التضخيم غير المحدد للحمض النووي. هناك نوعان من تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تفاعلين تضخيم متسلسل في مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل. خلال تفاعل التضخيم الأول ، يتم إنتاج منتج PCR. بعد التفاعل الأول ، يتم إجراء تفاعل تضخيم ثانٍ على منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل للتفاعل الأول.لذلك ، البادئات في خليط التفاعل الثاني ترتبط بمنتج PCR الأول وتضخمها.
الشكل 02: متداخلة PCR
تختلف أزواج البرايمر في كل تفاعل. يتم تقليل الارتباط غير المحدد للبادئات في تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل. تعد فحوصات PCR المتداخلة مفيدة لزيادة الحساسية و / أو الخصوصية. ومع ذلك ، يتطلب PCR المتداخلة معرفة التسلسل المهتم.
ما هي فحوصات PCR في الوقت الحقيقي؟
PCR في الوقت الحقيقي أو PCR الكمي (Q PCR) هو نسخة معدلة من PCR تقيس منتجات PCR من الناحية الكمية. لذلك ، تحدد هذه التقنية التضخيم في الوقت الفعلي باستخدام جهاز PCR في الوقت الفعلي. إنها أيضًا طريقة مناسبة لتحديد مقدار التسلسل المستهدف أو الجين الموجود في العينة.
الميزة المثيرة للاهتمام لـ PCR في الوقت الحقيقي هي أنها تجمع بين كل من التضخيم والقياس الكمي الحقيقي في خطوة واحدة. لذلك ، يمكن التخلص من الحاجة إلى الرحلان الكهربائي للهلام للكشف عن طريق تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي. سيؤدي استخدام الأصباغ الفلورية لتسمية منتجات PCR أثناء تفاعلات PCR في النهاية إلى القياس الكمي المباشر. عندما تتراكم منتجات PCR ، تتراكم إشارات الفلورسنت أيضًا ، وسيتم قياسها بواسطة آلة الوقت الفعلي. SYBR Green و Taqman هما طريقتان لاكتشاف أو مشاهدة عملية تضخيم PCR في الوقت الفعلي. كلتا الطريقتين تراقب تقدم عملية التضخيم وتبلغ عن كمية المنتج في الوقت الفعلي.
الشكل 03: PCR في الوقت الفعلي
يحتوي تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي على مجموعة متنوعة من التطبيقات مثل القياس الكمي للتعبير الجيني ، و microRNA وتحليل RNA غير المشفر ، والتنميط الجيني SNP ، واكتشاف متغيرات رقم النسخ ، واكتشاف الطفرات النادرة ، واكتشاف الكائنات المعدلة وراثيًا ، و الكشف عن العوامل المعدية
ما هي أوجه التشابه بين فحوصات PCR المتداخلة التقليدية وفي الوقت الفعلي؟
- فحوصات PCR المتداخلة والوقت الحقيقي هي تعديلات لمقايسة PCR التقليدية.
- جميع التقنيات الثلاثة تضخيم عينات الحمض النووي.
- يمكن استخدام منتجاتهم في التسلسل أو التحليل.
- هذه المقايسات تتطلب الاشعال
ما هو الفرق بين فحوصات PCR المتداخلة التقليدية والوقت الحقيقي؟
PCR التقليدية هي تقنية تم تطويرها لتضخيم تسلسل معين من الحمض النووي. وفي الوقت نفسه ، يعد Nested PCR تعديلًا لـ PCR التقليدي الذي يتكون من تفاعلين تضخيم متسلسل ، و PCR في الوقت الحقيقي هو متغير من PCR التقليدي القادر على تحديد المنتج المضخم.لذلك ، هذا هو الفرق الرئيسي بين فحوصات PCR التقليدية المتداخلة والوقت الحقيقي. على عكس PCR التقليدي وفي الوقت الحقيقي ، يستخدم PCR المتداخل مجموعتين من البرايمر. علاوة على ذلك ، هناك نوعان من تفاعلات التضخيم المتتالية في تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل من أجل تقليل التضخيم غير المحدد. بالإضافة إلى ذلك ، لا تحتوي مقايسات PCR التقليدية وفي الوقت الحقيقي على تفاعلين تضخيم متسلسل.
يسرد الرسم البياني التالي الاختلافات بين فحوصات PCR التقليدية المتداخلة والوقت الحقيقي في شكل جدول للمقارنة جنبًا إلى جنب.
ملخص - التقليدية مقابل فحوصات متداخلة مقابل فحوصات PCR في الوقت الفعلي
PCR التقليدي هو أول تقنية تم تطويرها لتضخيم أجزاء معينة من الحمض النووي. يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل و تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي نوعين مختلفين من تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي. هناك نوعان من تفاعلات التضخيم المتسلسلة واستخدام مجموعتين من البرايمر في تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل. تم تطوير PCR في الوقت الحقيقي لقياس منتج PCR المضخم. وبالتالي ، فإن هذا يلخص الفرق بين فحوصات PCR التقليدية المتداخلة والوقت الحقيقي.
