الفرق الرئيسي - استنساخ الجينات مقابل PCR
يسمى توليف العديد من نسخ الحمض النووي من جزء معين من الحمض النووي تضخيم الحمض النووي. هناك عمليتان رئيسيتان لتضخيم الحمض النووي وهما استنساخ الجينات و PCR. يتمثل الاختلاف الرئيسي بين استنساخ الجينات و PCR في أن استنساخ الجينات ينتج نسخًا متعددة من جين معين في الجسم الحي عن طريق بناء الحمض النووي المؤتلف والنمو داخل بكتيريا مضيفة بينما ينتج تفاعل البوليميراز المتسلسل ملايين النسخ من جزء معين من الحمض النووي في المختبر يخضع لدورات متكررة من تمسخ والتوليف.
ما هو الاستنساخ الجيني؟
الاستنساخ الجيني هو تقنية تستخدم لتحديد موقع ومضاعفة جين معين من الحمض النووي الجيني المستخرج للكائن الحي من خلال بناء الحمض النووي المؤتلف.يحتوي الحمض النووي الجينومي على آلاف الجينات المختلفة المشفرة للبروتينات. عندما يتم استخلاص الحمض النووي ، فإنه يشمل جميع الجينات التي يمكنه تحملها. مكنت تقنية استنساخ الجينات من اكتشاف جين معين من مجموع الحمض النووي. لذلك يعتبر الاستنساخ الجيني أداة مهمة في البيولوجيا الجزيئية.
يعد إنشاء مكتبة جينومية لكائن حي أمرًا ضروريًا في استنساخ الجينات إذا لم يكن هناك دليل حول موقع الجين ذي الصلة في الحمض النووي. يتم إنشاء مكتبة الجينوم باستخدام الخطوات التالية.
الخطوة 1: استخراج الحمض النووي الكلي من الكائن الحي الذي يحتوي على الجين المطلوب.
الخطوة 2: تقييد هضم الحمض النووي المستخرج لإنتاج أجزاء صغيرة يمكن التحكم فيها. يتم تسهيل هذه الخطوة من خلال نوكليازات التقييد.
الخطوة 3: اختيار ناقل مناسب وفتح ناقل DNA باستخدام نفس نوكليازات التقييد. تستخدم البلازميدات البكتيرية بشكل شائع كناقلات لنقل الحمض النووي الغريب. البلازميدات عبارة عن دوائر صغيرة من الحمض النووي تقع داخل البكتيريا.
الخطوة 4: الجمع بين ناقل الحمض النووي والحمض النووي المجزأ لإنتاج جزيء الحمض النووي المؤتلف. هذه الخطوة محكومة بـ DNA ligase.
الخطوة 5: نقل جزيئات الحمض النووي المؤتلف إلى البكتيريا المضيفة. تُعرف هذه الخطوة باسم التحول ، وتتم باستخدام الصدمة الحرارية.
الخطوة 5: فحص الخلايا البكتيرية المحولة على وسط مستنبت. يتم الحصول على مجموعة مختلطة من الخلايا المضيفة المحولة وغير المحولة في نهاية عملية التحول. حيث أن الجين المهم يشمل فقط الخلايا المضيفة المحولة. وبالتالي ، من الضروري تحديد الخلايا المحولة. يتم الاختيار باستخدام وسائط انتقائية تحتوي على مضادات حيوية. تنمو الخلايا المحولة فقط على وسيط الفرز هذا مما يتيح التحديد.
الخطوة 6: زراعة البكتيريا لإنتاج مكتبة جينية. في هذه الخطوة ، يتم إدخال الخلايا المضيفة المحولة في وسط مستنبت جديد يوفر متطلبات النمو المثلى. إجمالي المستعمرات على لوحات الثقافة تمثل المكتبة الجينومية لهذا الكائن الحي.
الخطوة 7: يجب فحص جزيء الحمض النووي المؤتلف الذي يحتوي على الجين المعني من آلاف الأجزاء المستنسخة من الحمض النووي المؤتلف. يمكن تحقيقه عن طريق استخدام المجسات التي تحدد الجين المحدد أو نتائج البروتين المحدد من هذا الجين.
بمجرد تحديد الجين المهتم الذي يحتوي على المستعمرة البكتيرية من إجمالي المستعمرات ، من الممكن صنع ملايين النسخ من البلازميد المؤتلف الذي يحتوي على الجين.
يُستخدم الاستنساخ الجيني في إنشاء مكتبات الجينات ، وإنتاج بروتينات خاصة ، وفيتامينات ، ومضادات حيوية ، وهرمونات ، وتسلسل ورسم خرائط جينومات الكائنات الحية ، وعمل نسخ متعددة من الحمض النووي للأفراد في الطب الشرعي وما إلى ذلك.
Figure_1: استنساخ الجينات
ما هو PCR؟
تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو تقنية تنتج عددًا كبيرًا من نسخ جزء معين من الحمض النووي. يتم الحصول على التضخيم الأسي لتسلسل DNA محدد بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل تحت ظروف المختبر. هذه التقنية هي أداة قوية للغاية في علم الأحياء الجزيئي حيث يمكنها مضاعفة عينة صغيرة من الحمض النووي إلى كمية قابلة للاستخدام. تم تقديم PCR بواسطة Kary Mullis في عام 1983 وخلق هذا الاختراع الحائز على جائزة تقدمًا هائلاً في علم الأحياء الجزيئي.
تتبع تقنية PCR تفاعلات PCR المتكررة كما هو موضح في الشكل 02. يتكون تفاعل PCR واحد من ثلاث خطوات رئيسية تحدث في ثلاث درجات حرارة مختلفة ؛ تغيير طبيعة مزدوج تقطعت به السبل في الحمض النووي عند 940C ، صلب الاشعال عند 680C واستطالة حبلا عند 720ج. لذلك ، عند إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، يجب الحفاظ على تقلبات درجة الحرارة بدرجة عالية من أجل النسخ المتماثل المناسب. يتم تنفيذ PCR في جهاز PCR داخل أنابيب PCR. يتم تحميل أنابيب PCR بمخاليط PCR الصحيحة التي تحتوي على قالب DNA و Taq polymerase و Primers و dNTPs و buffer.يتم تغيير طبيعة الحمض النووي للعينة المزدوجة التي تقطعت بهم السبل إلى الحمض النووي المفرد الذي تقطعت بهم السبل عن طريق كسر الروابط الهيدروجينية بين القواعد التكميلية عند 94-980C. ثم يتم كشف خيوط مفردة من قالب الحمض النووي للبادئات. يجب توفير زوج من البادئات (للأمام والخلف) ، ويجب أن تكون مقاومة للحرارة لتحمل درجات الحرارة المرتفعة. الاشعال عبارة عن تسلسلات DNA قصيرة مفردة تقطعت بهم السبل مكملة لنهايات جزء الحمض النووي المستهدف. تستخدم البادئات الاصطناعية في تفاعل البوليميراز المتسلسل. ترتبط المواد الأولية بالقواعد التكميلية لعينة الحمض النووي وتبدأ في تركيب خيط جديد. يتم تحفيز هذه الخطوة بواسطة إنزيم يسمى Taq polymerase ؛ إنزيم بوليميريز DNA القابل للحرارة المعزول من Thermus auqaticus. عندما تتوفر البادئات والنيوكليوتيدات (لبنات البناء) ، يبني Taq polymerase الخيط الجديد من DNA المكمل لقالب DNA. في نهاية برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لوحظ تضخيم جزء الحمض النووي باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام. في حالة الحاجة إلى مزيد من التحليل ، يتم تنقية منتج PCR من الجل.
PCR مفيد جدًا في تشخيص ومراقبة الأمراض الوراثية والمكتسبة ، وتحديد المجرمين (في مجال الطب الشرعي) ، ودراسة بنية ووظيفة جزء مستهدف من الحمض النووي ، وتسلسل ورسم خرائط جينومات الكائنات الحية ، أصبح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تقنية معملية روتينية في مختبرات أبحاث البيولوجيا الطبية والجزيئية بين العلماء نظرًا لأنه يحتوي على مجموعة متنوعة من التطبيقات.
Figure_2: تفاعل البلمرة المتسلسل
ما الفرق بين استنساخ الجينات و PCR؟
استنساخ الجينات مقابل PCR |
|
| الاستنساخ الجيني هو عملية صنع نسخ متعددة من جين معين في الجسم الحي من خلال الحمض النووي المؤتلف والتحول إلى بكتيريا مضيفة. | تنتج تقنية PCR نسخًا متعددة من تسلسل DNA معين في المختبر من خلال الدورات المتكررة لتفاعلات PCR. |
| متطلبات بناء الحمض النووي المؤتلف | |
| يتم إنتاج الحمض النووي المؤتلف من أجل تحديد موقع الجين. | لا يتم إنتاج الحمض النووي المؤتلف. |
| الحاجة إلى العمل | |
| هذه العملية كثيفة العمالة | ليست هناك حاجة لعمالة مكثفة. |
| عملية في الجسم الحي أو في المختبر | |
| بناء الحمض النووي المؤتلف في المختبر وتضخيم الحمض النووي في الجسم الحي. | تضخيم الحمض النووي يحدث بالكامل في المختبر. |
ملخص - استنساخ الجينات مقابل PCR
استنساخ الجينات و PCR طريقتان تستخدمان لتضخيم الحمض النووي. PCR هي عملية في المختبر تصنع نسخًا متعددة من الحمض النووي لجزء معين من الحمض النووي دون استخدام الحمض النووي المؤتلف والكائن الحي المضيف. استنساخ الجينات هو في الأساس عملية في الجسم الحي ينتج عنها نسخ متعددة من الجين المهتم داخل الكائن الحي المضيف عن طريق بناء الحمض النووي المؤتلف. هذا هو الفرق بين استنساخ الجينات و PCR.
