الفرق الرئيسي - تسلسل سانجر مقابل التسلسل الحراري
تسلسل الحمض النووي مهم جدًا لتحليل الحمض النووي لأن معرفة الترتيب الصحيح للنيوكليوتيدات في منطقة معينة من الحمض النووي يكشف عن العديد من المعلومات المهمة عنها. هناك طرق مختلفة لتسلسل الحمض النووي. يعد تسلسل سانجر والتسلسل الحراري طريقتين مختلفتين لتسلسل الحمض النووي تستخدمان على نطاق واسع في علم الأحياء الجزيئي. يتمثل الاختلاف الرئيسي بين تسلسل Sanger و Pyrosequencing في أن تسلسل Sanger يستخدم dideoxynucleotides لإنهاء تخليق الحمض النووي لقراءة تسلسل النوكليوتيدات بينما يكتشف التسلسل الحراري إطلاق البيروفوسفات من خلال دمج النيوكليوتيدات وتوليف التسلسل التكميلي لقراءة الترتيب الدقيق للتسلسل.
ما هو تسلسل سانجر؟
تسلسل Sanger هو طريقة الجيل الأول لتسلسل الحمض النووي التي طورها فريدريك سانجر وكلياته في عام 1977. ويُعرف أيضًا باسم تسلسل إنهاء السلسلة أو تسلسل Dideoxy نظرًا لأنه يعتمد على إنهاء السلسلة بواسطة ديديوكسينوكليوتيدات (ddNTPs). تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع لأكثر من 30 عامًا حتى تم تطوير تسلسل الجيل الجديد (NGS). مكنت تقنية تسلسل سانجر من اكتشاف الترتيب الصحيح للنيوكليوتيدات أو ربط جزء معين من الحمض النووي. يعتمد على التضمين الانتقائي لـ ddNTPs وإنهاء تخليق الحمض النووي أثناء تكرار الحمض النووي في المختبر. يعد غياب 3 مجموعات OH لمواصلة تكوين رابطة phosphodiester بين النيوكليوتيدات المجاورة ميزة فريدة لـ ddNTPs. ومن ثم ، بمجرد إرفاق ddNTP ، تتوقف استطالة السلسلة وتنتهي من تلك النقطة. هناك أربعة ddNTPs - ddATP و ddCTP و ddGTP و ddTTP - تُستخدم في تسلسل Sanger. توقف هذه النيوكليوتيدات عملية تكرار الحمض النووي عندما يتم دمجها في الخيط المتنامي للحمض النووي وتؤدي إلى أطوال مختلفة من الحمض النووي القصير.يستخدم الرحلان الكهربائي للهلام الشعري لتنظيم خيوط الحمض النووي القصيرة هذه حسب أحجامها على هلام كما هو موضح في الشكل 01.
الشكل 1: الرحلان الكهربائي للهلام الشعري للحمض النووي القصير المركب
لنسخ الحمض النووي في المختبر ، يجب توفير متطلبات قليلة. وهي عبارة عن إنزيم بوليميريز DNA ، قالب DNA ، بادئات قليلة النوكليوتيد ، و deoxynucleotides (dNTPs). في تسلسل Sanger ، يتم إجراء تكرار الحمض النووي في أربعة أنابيب اختبار منفصلة جنبًا إلى جنب مع أربعة أنواع من ddNTPs بشكل منفصل. لا يتم استبدال Deoxynucleotides بالكامل بـ ddNTPs المعنية. يتم تضمين خليط من dNTP (على سبيل المثال ؛ dATP + ddATP) في الأنبوب ويتم تكراره. يتم تشغيل أربعة منتجات أنابيب منفصلة على هلام في أربعة آبار منفصلة. ثم من خلال قراءة الهلام ، يمكن بناء التسلسل كما هو موضح في الشكل 02.
الشكل 02: تسلسل سانجر
تسلسل سانجر هو تقنية مهمة تساعد في العديد من مجالات البيولوجيا الجزيئية. اكتمل مشروع الجينوم البشري بنجاح بمساعدة طرق سانجر القائمة على التسلسل. تسلسل سانجر مفيد أيضًا في تسلسل الحمض النووي المستهدف ، وأبحاث السرطان والأمراض الوراثية ، وتحليل التعبير الجيني ، وتحديد هوية الإنسان ، واكتشاف مسببات الأمراض ، والتسلسل الجرثومي وما إلى ذلك.
هناك عدة عيوب لتسلسل سانجر:
- لا يمكن أن يكون طول الحمض النووي الذي يتم تسلسله أطول من 1000 زوج أساسي
- يمكن تسلسل خيط واحد فقط في كل مرة.
- العملية مستهلكة للوقت ومكلفة
لذلك ، تم تطوير تقنيات التسلسل المتقدمة الجديدة مع مرور الوقت للتغلب على هذه المشاكل. ومع ذلك ، لا يزال تسلسل Sanger قيد الاستخدام بسبب نتائجه عالية الدقة التي تصل إلى ما يقرب من 850 قطعة طول زوج أساسي.
ما هو Pyrosequencing؟
Pyrosequencing هي تقنية جديدة لتسلسل الحمض النووي تعتمد على "التسلسل بالتوليف". تعتمد هذه التقنية على الكشف عن إطلاق البيروفوسفات عند دمج النيوكليوتيدات. يتم استخدام هذه العملية بواسطة أربعة إنزيمات مختلفة: بوليمر الحمض النووي ، ATP سلفوريلاز ، وسيفيراز ، وأبيريز ، وركائزتين أدينوزين 5 'فسفوسلفات (APS) وسيفيرين.
تبدأ العملية بربط التمهيدي بقالب الحمض النووي أحادي السلسلة ويبدأ بوليميراز الحمض النووي في دمج النيوكليوتيدات المكملة له. عندما تتحد النيوكليوتيدات معًا (بلمرة الحمض النووي) ، فإنها تطلق مجموعات الطاقة والطاقة.كل إضافة نيوكليوتيد تطلق كمية متساوية من بيروفوسفات. يتحول بيروفوسفات إلى ATP بواسطة سلفوريلاز ATP في وجود ركيزة APS. يقود ATP المتولد تحويل لوسيفيراز بوساطة لوسيفيرين إلى أوكسيلوسيفيرين ، مما ينتج ضوءًا مرئيًا بكميات تتناسب مع كمية ATPs. يتم الكشف عن الضوء بواسطة جهاز الكشف عن الفوتون أو بواسطة المضاعف الضوئي وينتج صورة pyrogram. يحلل Apyrase ATP و dNTPs غير المدمجة في خليط التفاعل. تتم إضافة dNTP مرة واحدة في كل مرة. نظرًا لأن إضافة النيوكليوتيدات معروفة وفقًا لإدماج الضوء وكشفه ، يمكن تحديد تسلسل القالب. يستخدم Pyrogram لتوليد تسلسل النيوكليوتيدات لعينة DNA كما هو موضح في الشكل 03.
Pyrosequencing مهم جدًا في تحليل تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة وتسلسل الامتدادات القصيرة للحمض النووي. تعد الدقة العالية والمرونة وسهولة التشغيل الآلي والمعالجة المتوازية من مزايا التسلسل الحراري مقارنة بتقنيات تسلسل سانجر.
الشكل 03: التسلسل الحراري
ما هو الفرق بين Sanger Sequencing و Pyrosequencing؟
تسلسل سانجر مقابل التسلسل الحراري |
|
| تسلسل Sanger هو طريقة لتسلسل الحمض النووي تعتمد على التضمين الانتقائي لـ ddNTPs بواسطة بوليميريز الحمض النووي وإنهاء السلسلة. | Pyrosequencing هي طريقة لتسلسل الحمض النووي تعتمد على الكشف عن إطلاق البيروفوسفات عند دمج النيوكليوتيدات. |
| استخدام ddNTP | |
| ddNTPs تستخدم لإنهاء تكرار الحمض النووي | ddNTPs غير مستخدمة. |
| مشاركة الانزيمات | |
| يتم استخدام بوليميريز الحمض النووي. | يتم استخدام أربعة إنزيمات: DNA polymerase و ATP sulfurylase و Luciferase و Apyrase. |
| الركائز المستخدمة | |
| APS و Luciferin غير مستخدمين | أدينوسين 5 'فسفوسلفات (APS) ولوسيفيرين تستخدم. |
| درجة الحرارة القصوى | |
| هذه عملية بطيئة | هذه عملية سريعة |
ملخص - تسلسل سانجر مقابل التسلسل الحراري
تسلسل Sanger و Pyrosequencing هما طريقتان لتسلسل الحمض النووي المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية. يبني تسلسل سانجر ترتيب النيوكليوتيدات بالتسلسل عن طريق إنهاء استطالة السلسلة بينما يبني التسلسل الحراري الترتيب الدقيق للنيوكليوتيدات بالتسلسل عن طريق دمج النيوكليوتيدات واكتشاف إطلاق البيروفوسفات.لذلك ، فإن الاختلاف الرئيسي بين تسلسل Sanger و Pyrosequencing هو أن تسلسل Sanger يعمل على التسلسل عن طريق إنهاء السلسلة بينما يعمل التسلسل الحراري على التسلسل عن طريق التوليف.
